Validação de um sistema para análise funcional de genes em Phakopsora pachyrhizi via silenciamento gênico mediado por aplicação ectópica de dsRNA
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Data
2018-07-31
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Universidade Estadual do Norte do Paraná
Resumo
O mecanismo de silenciamento gênico (RNAi) mediado pela aplicação direta de dsRNA vem se tornando uma estratégia promissora tanto para a análise funcional de genes quanto para o controle de pragas e patógenos. Embora ainda não se conheça detalhadamente a maquinaria de silenciamento de Phakopsora pachyrhizi, a possibilidade de aplicação desse sistema em um fungo biotrófico de elevado poder destrutivo para a soja, uma das principais commodities mundiais, torna-se especialmente atrativa. Realizou-se a pulverização direta de GFP-dsRNA em folhas destacadas de soja e observou-se que o dsRNA é absorvido pelo tecido foliar e detectável ao longo de todo o ciclo de infecção do fungo, sendo inclusive transmitido à primeira geração de esporos. Verificou-se, ainda, que o GFP-dsRNA localiza-se predominantemente no tubo germinativo dos esporos. Em seguida, tendo como alvo um gene candidato a essencial ao desenvolvimento de P. pachyrhizi (de_novo_4692), observou-se silenciamento dependente da dose, com redução relativa de até 86,6%, tendo o maior efeito sido constatado na menor dose avaliada (50 ng/μL). O ensaio de fenotipagem quanto à severidade da doença em folhas destacadas tratadas revelou redução significativa dos sintomas. Esses resultados demonstram que a aplicação foliar direta de dsRNA é capaz de induzir o silenciamento de genes do fungo, indicando que essa estratégia apresenta potencial para estudos funcionais e configura-se como uma alternativa inovadora ao uso de fungicidas convencionais.
Abstract
RNA interference (RNAi) induced by direct dsRNA application has emerged as a promising strategy both for functional gene analysis and for the management of pests and pathogens. Although the RNA-silencing machinery of Phakopsora pachyrhizi remains uncharacterized, the prospect of applying this approach to an obligate biotrophic pathogen that severely impacts soybean, one of the world’s most important commodities, is particularly attractive. We sprayed GFP-dsRNA directly onto detached soybean leaves and observed that dsRNA was taken up by the foliage, remained detectable throughout the fungal infection cycle, and was even transmitted to the first generation of spores. GFP-dsRNA fluorescence was observed predominantly in the spore germ tubes. We then targeted a predicted essential gene from P. pachyrhizi (de_novo_4692) and recorded a dose-dependent silencing efficiency of up to 86.6%, with the strongest effect occurring at the lowest dose tested (50 ng/μL). Disease-severity assays on silenced detached leaves revealed a significant reduction in symptom development. These results demonstrate that foliar dsRNA application effectively triggers target-gene silencing in P. pachyrhizi, indicating that this approach holds promise for functional genomic studies and represents an innovative alternative to conventional fungicides.
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Citação
COSTA, Roberta de Paula Saturnino. Validação de um sistema para análise funcional de genes em Phakopsora pachyrhizi via silenciamento gênico mediado por aplicação ectópica de dsRNA. Orientadora: Mayra Costa da Cruz Gallo de Carvalho. 2018. 48 p. Dissertação (Mestrado em Agronomia) – Centro de Ciências Agrárias, Campus Luiz Meneghel, Universidade Estadual do Norte do Paraná, Bandeirantes, 2018.
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